本發(fā)明屬于中藥材的性質(zhì)測(cè)定領(lǐng)域，具體是指一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法。
背景技術(shù)：
1、人參來(lái)源于五加科植物人參（panax?ginseng?c.?a.?mey.）的干燥根及根莖，素有“百藥之王”的美譽(yù)，具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺等功效，其質(zhì)量常與生長(zhǎng)年限和栽培方式（如園參、林下參）等因素密切相關(guān)。例如，林下參因生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)且環(huán)境脅迫條件更接近野生狀態(tài)，其皂苷含量通常高于園參。
2、草酸鈣簇晶作為植物代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵形態(tài)標(biāo)志物，其顯微特征（晶型、密度等）在中藥鑒別與質(zhì)量評(píng)價(jià)中具有重要作用。當(dāng)前《中國(guó)藥典》人參項(xiàng)下僅規(guī)定了草酸鈣簇晶的直徑范圍（20～68μm）。然而，研究表明，人參中草酸鈣簇晶的密度與生長(zhǎng)年限和環(huán)境密切相關(guān)。例如，林下參中的草酸鈣簇晶數(shù)量（172-383個(gè)/mg）顯著高于園參（33-144個(gè)/mg），且人參中草酸鈣簇晶數(shù)量遠(yuǎn)高于西洋參。
3、近年來(lái)，利用雙折射效應(yīng)的偏光顯微技術(shù)顯著增強(qiáng)了顯微特征的辨識(shí)度，在中藥顯微鑒定中應(yīng)用廣泛。草酸鈣簇晶在偏光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮的雙折射特征，為人參的顯微鑒定提供了更可靠的依據(jù)。
4、已有研究嘗試?yán)闷胀ü鈱W(xué)顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)草酸鈣簇晶以鑒別人參。然而，該方法存在顯著局限：人工計(jì)數(shù)主觀性強(qiáng)，誤差率達(dá)15%-20%；且難以克服樣品制備過程中草酸鈣結(jié)晶易碎片化的問題，普通光學(xué)顯微鏡下無(wú)法統(tǒng)計(jì)面積<5μm2的微小碎片，漏檢率超過17%（結(jié)果見圖1），導(dǎo)致信息采集不完整、數(shù)據(jù)代表性不足；此外，操作過程耗時(shí)費(fèi)力，單樣本計(jì)數(shù)分析耗時(shí)超過30分鐘，難以滿足高通量快速檢測(cè)的需求。因此，亟需建立一種客觀、高效且更為精準(zhǔn)的草酸鈣結(jié)晶顯微定量方法，以提升人參質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別的科學(xué)性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明主要解決的是現(xiàn)有技術(shù)中人工計(jì)數(shù)誤差大、數(shù)據(jù)采集不完整、檢測(cè)效率低等缺陷。
2、為解決上述問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提出的人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，包括以下步驟：
3、s1.樣品粉碎、過篩、精密稱定、制備供試品混懸液、渦旋并裝片；
4、s2.在偏光顯微鏡下采集全視野顯微圖像；
5、s3.對(duì)圖像進(jìn)行色彩分離、背景校正、灰度轉(zhuǎn)換及閾值分割處理，計(jì)算全視野草酸鈣結(jié)晶截面面積；
6、s4.基于草酸鈣結(jié)晶截面面積與樣品干重的計(jì)算公式，計(jì)算得出單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積；
7、s5.通過單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積，實(shí)現(xiàn)人參的真?zhèn)舞b別、林下參與園參的分類評(píng)定，其中人參的真?zhèn)舞b別主要為區(qū)分西洋參與人參。
8、進(jìn)一步地，所述步驟s1中樣品粉碎至過4號(hào)藥典篩，所述步驟s1中供試品混懸液濃度為20-50mg/ml，最佳濃度為30mg/ml，其中供試品混懸液制備所用裝置液為50％甘油：0.5％羧甲基纖維素鈉：水=9:8:3（體積比），所述步驟s1中渦旋是指樣品混懸液須渦旋（5000rpm）處理≥2s，若渦旋頻率改變，處理時(shí)間可調(diào)整，所述步驟s1中取樣應(yīng)在渦旋后5s內(nèi)完成，所述供試品混懸溶液的取樣量為2μl，其中取樣位置為離心管最底部，所述步驟s1中裝片是指將樣品溶液分布于細(xì)胞計(jì)數(shù)板網(wǎng)格線內(nèi)。
9、進(jìn)一步地，所述步驟s2中偏光顯微鏡參數(shù)為：目鏡10倍，物鏡10倍，偏光度40°，光源色溫5500±500k。
10、進(jìn)一步地，所述步驟s3中色彩分離是指僅保留圖片中草酸鈣結(jié)晶的綠色波段（500-600nm）顏色，所述步驟s3中背景校正采用閾值自動(dòng)適應(yīng)法將圖片背景轉(zhuǎn)換為黑色，所述步驟s3中灰度轉(zhuǎn)換是指將圖片轉(zhuǎn)換為8bit灰度值，所述步驟s3中閾值分割采用自適應(yīng)閾值分割，所述步驟s3中草酸鈣結(jié)晶截面面積采用軟件批處理功能計(jì)算。
11、進(jìn)一步地，所述步驟s4中計(jì)算單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積的公式為：
12、單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積（d，μm2/mg）=σs/[m×(1-w)×v1/v0]；
13、其中：σs為制片中草酸鈣結(jié)晶總截面面積（μm2），m為供試品稱樣量（mg），w為樣品中含水量（%），v1為制片取樣體積（ml），v0為供試品混懸液總體積（ml）。
14、進(jìn)一步地，所述步驟s5中通過單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積區(qū)分西洋參與人參，以及區(qū)分園參與林下參，其中西洋參的單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積顯著低于人參，園參的單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積顯著低于林下參。
15、采用上述步驟本發(fā)明取得的有益效果如下：
16、1、本方案提出的人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，采用偏光顯微鏡觀察人參中的草酸鈣結(jié)晶，能更完整清晰地拍攝和采集草酸鈣結(jié)晶信息，包括完整的草酸鈣簇晶和破碎的草酸鈣結(jié)晶，降低漏檢率。
17、2、本方案提出的人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，供試品的混懸過程中，裝置液中加入助懸劑羧甲基纖維素鈉和保濕劑甘油，二者合適的比例可實(shí)現(xiàn)樣品粉末的均勻懸浮，保證測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
18、3、本方案提出的人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，對(duì)標(biāo)本片開展全視野圖像采集，保障了測(cè)量結(jié)果的全面性和代表性，最大程度降低了人工計(jì)數(shù)以部分代表整體導(dǎo)致的定量誤差，提升了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。
19、4、本方案提出的人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，圖像分析技術(shù)的引入，測(cè)定樣品中草酸鈣結(jié)晶的單位質(zhì)量截面面積，使人參中草酸鈣結(jié)晶的定量檢測(cè)更加精準(zhǔn)、高效。
1.一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，其特征在于：所述步驟s1中樣品粉碎至過4號(hào)藥典篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，其特征在于：所述步驟s1中供試品混懸液濃度為20-50mg/ml，最佳濃度為30mg/ml，其中供試品混懸液制備所用裝置液為50％甘油：0.5％羧甲基纖維素鈉：水=9:8:3（體積比）。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，其特征在于：所述步驟s1中渦旋是指樣品混懸液須渦旋（5000rpm）處理≥2s，若渦旋頻率改變，處理時(shí)間可調(diào)整，所述步驟s1中取樣應(yīng)在渦旋后5s內(nèi)完成，所述供試品混懸溶液的取樣量為2μl，其中取樣位置為離心管最底部。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，其特征在于：所述步驟s1中裝片是指將樣品溶液分布于細(xì)胞計(jì)數(shù)板網(wǎng)格線內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，其特征在于：所述步驟s2中偏光顯微鏡參數(shù)為：目鏡10倍，物鏡10倍，偏光度40°，光源色溫5500±500k。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，其特征在于：所述步驟s3中色彩分離是指僅保留圖片中草酸鈣結(jié)晶的綠色波段（500-600nm）顏色，所述步驟s3中背景校正采用閾值自動(dòng)適應(yīng)法將圖片背景轉(zhuǎn)換為黑色，所述步驟s3中灰度轉(zhuǎn)換是指將圖片轉(zhuǎn)換為8bit灰度值，所述步驟s3中閾值分割采用自適應(yīng)閾值分割，所述步驟s3中草酸鈣結(jié)晶截面面積采用軟件批處理功能計(jì)算。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，其特征在于：所述步驟s4中計(jì)算單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積的公式為：
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人參中草酸鈣結(jié)晶的偏光顯微定量方法，其特征在于：所述步驟s5中通過單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積區(qū)分西洋參與人參，以及區(qū)分園參與林下參，其中西洋參的單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積顯著低于人參，園參的單位質(zhì)量草酸鈣結(jié)晶截面面積顯著低于林下參。