本發(fā)明屬于生物，尤其涉及一種黑松露來源的植物細胞囊泡的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、隨著精準醫(yī)學(xué)和天然產(chǎn)物開發(fā)的快速發(fā)展，植物來源的細胞外囊泡（plant-derived?extracellular?vesicles,?pdevs）因其獨特的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)、低免疫原性和天然靶向特性，成為新型藥物遞送系統(tǒng)的研究熱點。黑松露（tuber?spp.）作為世界公認的頂級食材，其子實體中含有豐富的鞘脂類物質(zhì)和活性肽，但其細胞壁致密的多糖-木質(zhì)素復(fù)合結(jié)構(gòu)導(dǎo)致常規(guī)物理破碎法難以高效獲取內(nèi)源性囊泡。
2、現(xiàn)有技術(shù)中，黑松露活性成分的提取主要依賴超臨界co2萃?。▔毫?5-25mpa，溫度35-45℃）和有機溶劑分級沉淀等方法。部分現(xiàn)有技術(shù)雖通過20khz超聲波處理提高了多糖得率，但未涉及囊泡結(jié)構(gòu)的完整分離?，F(xiàn)有技術(shù)采用高壓均質(zhì)聯(lián)合膜過濾技術(shù)，雖能獲得粒徑分布較窄的納米顆粒，但存在設(shè)備投資大、能耗高的缺陷。
3、研究表明，傳統(tǒng)超臨界萃取技術(shù)在提取油脂成分時具有選擇性優(yōu)勢，但對于細胞外囊泡這類生物膜結(jié)構(gòu)存在顯著破壞作用。當萃取壓力超過20mpa時，囊泡雙層脂膜的流動性會急劇下降，導(dǎo)致膜蛋白變性。此外，商業(yè)化超臨界設(shè)備通常配備夾帶劑系統(tǒng)，易造成乙醇等有機溶劑殘留，影響后續(xù)生物醫(yī)藥應(yīng)用的合規(guī)性。
4、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明創(chuàng)新性地結(jié)合生物酶解與物理分離技術(shù)，在溫和條件下實現(xiàn)黑松露細胞囊泡的高效制備。通過優(yōu)化復(fù)合酶配比和酶解動力學(xué)參數(shù)，特異性降解細胞壁組分而不破壞囊泡結(jié)構(gòu)完整性。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明首先提供一種黑松露來源的植物細胞囊泡的制備方法，包括以下步驟：
2、(1)黑松露原料經(jīng)冷凍干燥、超微粉碎后，與磷酸鹽緩沖液混合進行酶解；
3、(2)酶解產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎，獲得富含囊泡的級分；
4、(3)通過超濾膜分離及蔗糖密度梯度離心純化，得到粒徑為30-200nm的植物細胞囊泡；
5、(4)冷凍干燥，即得成品。
6、在某些實施例中，步驟(1)中所述酶解采用復(fù)合酶體系，包括纖維素酶、β-葡聚糖酶和木瓜蛋白酶。
7、在某些實施例中，步驟(1)中酶解溫度為50-60℃，時間為1-3小時。
8、在某些實施例中，步驟(3)中超濾膜的截留分子量為10-50?kda，蔗糖密度梯度離心的密度梯度范圍為1.063-1.21?g/ml。
9、在某些實施例中，所述植物細胞囊泡的zeta電位為-20至-40?mv，包封率為≥85%。
10、在某些實施例中，所述黑松露為黑孢塊菌（tuber?melanosporum）或夏塊菌（tuberaestivum）。
11、本發(fā)明還提供上述方法制備的黑松露來源植物細胞囊泡的應(yīng)用，將其作為藥物載體用于遞送活性成分。
12、本發(fā)明還提供上述方法制備的黑松露來源植物細胞囊泡的應(yīng)用，將其用于化妝品組合物中，提升活性成分的透皮吸收率。
13、本發(fā)明還提供上述方法制備的黑松露來源植物細胞囊泡的應(yīng)用，將其包載抗氧化劑用于功能性食品的制備。
14、本發(fā)明最后還提供一種化妝品組合物，包含上述方法制備的黑松露來源植物細胞囊泡，以及多肽、多糖和保濕劑。
15、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：
16、（1）創(chuàng)新性采用復(fù)合酶解體系，實現(xiàn)細胞壁選擇性降解，囊泡完整率＞92%；
17、（2）囊泡可作為藥物載體用于抗炎成分遞送，可以促進hacat細胞遷移，具有較佳的促進皮膚修復(fù)的能力，能夠制備醫(yī)美產(chǎn)品。
1.一種黑松露來源的植物細胞囊泡的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述植物細胞囊泡的zeta電位為-20至-40mv，包封率≥85%。
3.一種黑松露來源植物細胞囊泡，其特征在于，所述黑松露來源植物細胞囊泡由權(quán)利要求1-2任一所述方法制備得到。
4.一種如權(quán)利要求3所述的黑松露來源植物細胞囊泡的應(yīng)用，其特征在于，將其作為藥物載體用于遞送活性成分。
5.一種如權(quán)利要求3所述的黑松露來源植物細胞囊泡的應(yīng)用，其特征在于，將其用于化妝品組合物中，提升活性成分的透皮吸收率。
6.一種如權(quán)利要求3所述的黑松露來源植物細胞囊泡的應(yīng)用，其特征在于，將其包載抗氧化劑用于功能性食品的制備。
7.一種化妝品組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求3所述的黑松露來源植物細胞囊泡，以及多肽、多糖和保濕劑。