本發(fā)明涉及微生物代謝工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，特別涉及一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的重組鹽單胞菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、聚羥基脂肪酸酯（pha）是一類由微生物通過(guò)生物合成途徑產(chǎn)生的高分子聚合物，作為一種完全生物合成并可生物降解的塑料材料，pha具有良好的機(jī)械性能、熱穩(wěn)定性和可加工性。由于其環(huán)保特性和可降解性，pha在醫(yī)療器械、包裝材料、紡織、農(nóng)業(yè)薄膜、食品包裝等多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，成為近年來(lái)產(chǎn)業(yè)界和科研領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。當(dāng)前研究和產(chǎn)業(yè)化的pha共聚物主要包括聚-3-羥基丁酸酯（phb）、聚-3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯（phbv）、聚-3-羥基丁酸酯-4-羥基丁酸酯（p34hb）及其衍生物，如聚-3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯（p34hb3hv）。這些pha共聚物在分子結(jié)構(gòu)上通過(guò)不同的單體組合形成，能夠賦予pha不同的性能，以滿足不同應(yīng)用的需求。然而，目前許多pha共聚物的生產(chǎn)依賴于大腸桿菌、假單胞菌、羅氏真氧桿菌等微生物，這些微生物通過(guò)代謝工程和基因改造被設(shè)計(jì)成能夠合成pha共聚物。盡管這些微生物在pha生產(chǎn)中取得了一定的成功，但它們的代謝途徑往往受到一些限制。例如，許多菌株對(duì)外源底物的利用效率較低，導(dǎo)致合成效率不高，且一些菌株的代謝途徑較為復(fù)雜，容易導(dǎo)致不必要的副產(chǎn)物生成，降低了生產(chǎn)過(guò)程的整體效率和成本效益。

2、此外，在pha共聚物的生產(chǎn)過(guò)程中，尤其是phbv、p34hb、p34hb3hv等共聚物中，各單體的比例是決定材料性能的關(guān)鍵。然而，傳統(tǒng)發(fā)酵方法所得到的pha共聚物中各單體比例較低且控制比較困難。因此需要一個(gè)更強(qiáng)大的微生物底盤在控制成本的基礎(chǔ)上來(lái)提高和調(diào)節(jié)pha共聚物中的各單體比例。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提出一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的重組鹽單胞菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的重組鹽單胞菌，所述重組鹽單胞菌包含外源基因，所述外源基因包括 aldd基因（醛脫氫酶）、 dhat基因（1,3-丙二醇脫氫酶）和 orfz基因（4-羥基丁酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶）的組合，并且，所述的重組鹽單胞菌弱化表達(dá)內(nèi)源性 prpc基因（2-甲基檸檬酸合成酶）；所述 aldd基因來(lái)源于惡臭假單胞菌、鹽單胞菌、羅氏真氧桿菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中的任意一種，優(yōu)選為惡臭假單胞菌；

3、所述 dhat基因來(lái)源于惡臭假單胞菌、鹽單胞菌和肺炎克雷伯菌中的任意一種，優(yōu)選為惡臭假單胞菌；

4、所述 orfz基因來(lái)源于克氏梭菌、大腸桿菌、羅氏真氧桿菌、鼠傷寒沙門菌和羅伊氏乳桿菌中的任意一種，優(yōu)選為克氏梭菌。

5、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述 aldd基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述 dhat基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述 orfz基因的核苷酸序列如seq?idno.3所示；所述 prpc基因的核苷酸序列如seq?id?no.18所示。

6、所述弱化表達(dá)可以為基因敲除或者敲低（例如基因沉默）。

7、在一些實(shí)施方式中，所述外源基因還包括 scpa基因（甲基丙二酰輔酶a突變酶）和 scpb基因（甲基丙二酰輔酶a脫羧酶）；

8、所述 scpa基因和 scpb基因獨(dú)自來(lái)源于大腸桿菌、惡臭假單胞菌、鹽單胞菌和羅氏真氧桿菌中的任意一種；

9、優(yōu)選地，所述 scpa基因和 scpb基因獨(dú)自來(lái)源于大腸桿菌。

10、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述 scpa基因的核苷酸序列如seq?id?no.25所示，所述 scpb基因的核苷酸序列如seq?id?no.26所示。

11、在一些實(shí)施方式中，所述外源基因還包括 acs基因；

12、所述 acs基因來(lái)源于大腸桿菌、惡臭假單胞菌、鹽單胞菌和羅氏真氧桿菌中的任意一種；優(yōu)選為大腸桿菌。

13、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述 acs基因的核苷酸序列如seq?id?no.13所示。

14、在一些實(shí)施方式中，所述外源基因在質(zhì)粒上表達(dá)和/或在染色體上表達(dá)。

15、在一些實(shí)施方式中，所述的質(zhì)?？梢詫⑼庠椿蛘现寥旧w基因組表達(dá)也可以使外源基因在質(zhì)粒上表達(dá)；當(dāng)在質(zhì)粒上表達(dá)時(shí)，所述的質(zhì)?？梢詾楦呖截愘|(zhì)?；虻涂截愘|(zhì)粒。

16、在一些實(shí)施方式中，所述的高拷貝質(zhì)粒如pseva341、cole1、pmb1、puc（如puc18、puc19等）、pbluescript（如pbluescript?ii?ks+、pbluescript?ii?sk+等）、ptz57r、pgem等。

17、在一些實(shí)施方式中，所述的低拷貝質(zhì)粒如pre系列（如pre112）、pseva321、psc101、pacyc184、pwe15、pet系列（如pet-15b和pet-28a）。

18、在一些實(shí)施方式中，所述的敲除可以采用crispr/cas9基因組編輯方法、化學(xué)誘變、t-dna插入突變、病毒誘導(dǎo)的基因沉默、使用自殺質(zhì)粒、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)核酸酶（talen）技術(shù)或鋅指核酸酶技術(shù)。

19、其中，所述的敲除可以為敲除目的基因的全部或部分核苷酸序列，或者敲除目的基因的調(diào)控元件或相關(guān)調(diào)節(jié)基因，使得目的基因在重組菌中不表達(dá)或者表達(dá)的蛋白不具有功能。

20、在一些實(shí)施方式中，所述的自殺質(zhì)粒包括pre112、pk18mobsacb或pdm4中的一種或兩種以上。

21、在一些實(shí)施方式中，所述的敲低可以采用rna干擾技術(shù)，所述的rna干擾技術(shù)包括使用sirna或shrna靶向降解目的基因。

22、在一些實(shí)施方式中，所述鹽單胞菌為鹽單胞菌屬，為或其衍生菌、 halomonas?campaniensis或其衍生菌和 halomonas?aydingkolgenesis或其衍生菌中的任意一種。

23、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述的鹽單胞菌優(yōu)選為 halomonas?lutescensmdf-9（公開于專利cn113801810a中，保藏編號(hào)為gdmcc?no.61850）、ly01（公開于專利cn116396886a中，保藏編號(hào)為gdmcc?no:62635）、ly02（公開于專利cn116925981a中，保藏編號(hào)為gdmcc?no:63381）、ly03（公開于專利cn116970538a中，保藏編號(hào)為gdmcc?no.?63382）；ly04（公開于專利cn117551585a中，保藏編號(hào)為gdmcc?no.63383）。

24、本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中所使用的泥色鹽單胞菌 halomonas?lutescensmdf-9可以在高鹽高堿的環(huán)境下正常生長(zhǎng)，從而避免了污染風(fēng)險(xiǎn)并且省去了滅菌程序，這大大降低了生產(chǎn)成本。通過(guò)代謝工程改造使其擁有了合成多種pha共聚物的能力，并且在研究中發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加少量短鏈脂肪酸可以提高共聚物中的單體比例。

25、本發(fā)明還提供所述的重組鹽單胞菌的構(gòu)建方法，所述重組鹽單胞菌過(guò)表達(dá)所述的外源基因，并且，所述的重組鹽單胞菌敲除或敲低內(nèi)源性 prpc基因。

26、本發(fā)明所述的“過(guò)表達(dá)”為將目的基因上調(diào)表達(dá)，高于原本天然（例如原始菌株）的表達(dá)量或使得原本不表達(dá)變?yōu)楸磉_(dá)。例如可以通過(guò)提高啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度，或者導(dǎo)入基因的拷貝數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

27、本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，所述方法包括發(fā)酵培養(yǎng)所述的重組鹽單胞菌。

28、聚羥基脂肪酸酯（pha）為單體的均聚物或共聚物。

29、所述的單體包括但不限于3-羥基丁酸（3-hb）、3-羥基戊酸（3-hv）、4-羥基丁酸（4-hb）、4-羥基戊酸（4-hv）等等。

30、可以是短鏈pha或者中長(zhǎng)鏈pha。具體地，pha可以是聚-3-羥基丁酸酯（其是較常見的聚羥基脂肪酸酯，簡(jiǎn)稱為phb）、聚-3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯（phbv）、聚-3-羥基丁酸酯-4-羥基丁酸酯（p34hb）、聚-3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯（p34hb3hv）等等或其組合。

31、聚羥基脂肪酸酯的生產(chǎn)方法可以以分批發(fā)酵的方式進(jìn)行，也可以以連續(xù)發(fā)酵或者補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式進(jìn)行。發(fā)酵可以根據(jù)情況任選地執(zhí)行期望的時(shí)長(zhǎng)，例如12小時(shí)至120小時(shí)，比如24小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)、72小時(shí)等等，但不限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以視具體情況適當(dāng)?shù)剡x擇發(fā)酵時(shí)間。這些發(fā)酵方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)期望的目的和實(shí)驗(yàn)條件適當(dāng)?shù)剡x擇任一種發(fā)酵方式來(lái)執(zhí)行本發(fā)明的方法。

32、在上述生產(chǎn)pha的方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基在添加到發(fā)酵體系之前，可以進(jìn)行滅菌處理，也可以不進(jìn)行處理直接添加到發(fā)酵體系中。并且，發(fā)酵體系可以維持在開放式的免無(wú)菌條件（即，可以直接暴露于環(huán)境中，不需要采用避免雜菌污染的封閉發(fā)酵條件）下，也可以維持為避免雜菌污染的封閉條件下。

33、培養(yǎng)基可以根據(jù)該菌的特性結(jié)合本領(lǐng)域知曉的微生物培養(yǎng)技術(shù)來(lái)選擇，通常其可包括營(yíng)養(yǎng)源（如碳源和/或氮源）、能量源、必需礦物質(zhì)。例如，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的礦物質(zhì)培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基、mm培養(yǎng)基、mm-g培養(yǎng)基或牛肉膏蛋白胨等等，也可以是在這些培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上根據(jù)期望目的進(jìn)行改良的培養(yǎng)基。

34、所述發(fā)酵的培養(yǎng)基可以為液體、固體或半固體。

35、培養(yǎng)基可以包含碳源和氮源，并且/或者也可以在發(fā)酵工序中將碳源和/或氮源補(bǔ)充添加到培養(yǎng)發(fā)酵體系中。碳源可以是例如糖類、油脂、有機(jī)酸及有機(jī)酸酯等等，但不限于此。氮源可以是有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源或其混合，例如牛肉膏、酵母膏、玉米漿粉、餅粕粉、尿素、蛋白胨、明膠、硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀等等，但不限于此。

36、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，發(fā)酵所用的發(fā)酵培養(yǎng)基采用50mm培養(yǎng)基。

37、在一些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)使用的發(fā)酵培養(yǎng)基中包含短鏈脂肪酸，所述短鏈脂肪酸的濃度為0.25~30g/l；優(yōu)選地，所述短鏈脂肪酸的濃度為0.25~10?g/l。

38、在一些實(shí)施方式中，所述短鏈脂肪酸包括但不限于甲酸如甲酸鹽和甲酸酯等，乙酸如乙酸鹽和乙酸酯等，丙酸如丙酸鹽和丙酸酯等，丁酸如丁酸鹽和丁酸酯等。

39、本發(fā)明還提供一種調(diào)節(jié)聚羥基脂肪酸酯單體比例的方法，所述的方法包括發(fā)酵培養(yǎng)所述的重組鹽單胞菌；

40、通過(guò)調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸的添加量進(jìn)一步提高pha的產(chǎn)量以及調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸中單體比例。

41、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了5~10g/l乙酸，提高pha的產(chǎn)量及4hb單體的比例。

42、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了0.25~0.5g/l丙酸，提高pha的產(chǎn)量及3hv單體的比例。

43、在一些實(shí)施方式中，所述重組鹽單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)溫度可以在30~42℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在32~40℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，在35~38℃的范圍內(nèi)。

44、在一些實(shí)施方式中，發(fā)酵體系的初始ph值可以在6.5~11范圍內(nèi)、優(yōu)選7~10范圍內(nèi)。

45、本發(fā)明還提供所述的重組鹽單胞菌在制備可降解的生物新材料中的應(yīng)用。

46、綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明達(dá)到了以下技術(shù)效果：

47、1、本發(fā)明通過(guò)外源引入從1，4丁二醇（bdo）到4-羥基丁?；o酶a的合成途徑，成功構(gòu)建了p34hb合成途徑，能夠有效調(diào)控共聚物中各單體的比例，尤其是在外源添加短鏈脂肪酸（如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等）后，可以進(jìn)一步提高phb、phbv、p34hb、p34hb3hv等共聚物的合成，并調(diào)節(jié)不同單體的比例，增強(qiáng)了共聚物的多樣性和產(chǎn)量。

48、2、本發(fā)明外源引入3hv的從頭合成途徑，并敲除丙酰輔酶a的降解途徑，不僅提高了3hv單體的合成效率，還優(yōu)化了整個(gè)合成過(guò)程，顯著提高了最終共聚物的產(chǎn)量及其單體的比例，有效提高了目標(biāo)共聚物的合成效率和經(jīng)濟(jì)效益。