本發(fā)明屬于環(huán)境微生物，具體涉及一種提升中溫和中高溫纖維素厭氧產(chǎn)甲烷率的厭氧菌劑及方法。

背景技術(shù)：

1、生物質(zhì)廢棄物厭氧產(chǎn)沼能源化利用是實現(xiàn)資源再利用的途徑之一。目前，大部分用于厭氧產(chǎn)沼的生物質(zhì)原料，如農(nóng)作物秸稈、牛糞、廚余垃圾等，富含纖維素、半纖維素。然而，由于纖維素和半纖維素外通常包裹著一層結(jié)構(gòu)復(fù)雜的致密且極難降解的木質(zhì)素成分，阻礙了胞外水解酶與其直接接觸，導(dǎo)致水解效率低下，甲烷轉(zhuǎn)化率低。因此，如何提升纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)化是生物質(zhì)廢棄物厭氧產(chǎn)沼行業(yè)亟待突破的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸問題。

2、目前，厭氧產(chǎn)沼工程中通常使用中溫發(fā)酵和高溫發(fā)酵。其中，中溫發(fā)酵的溫度區(qū)間為30~40℃，高溫發(fā)酵的溫度區(qū)間為50℃以上。在兩者各自的溫度區(qū)間范圍內(nèi)，中溫發(fā)酵的最適應(yīng)溫度范圍為35~40℃，高溫發(fā)酵的最適應(yīng)溫度范圍為50~55℃。但在中溫發(fā)酵和高溫發(fā)酵之間還存在一個中高溫發(fā)酵的過渡溫度區(qū)間，即40~50℃。經(jīng)過研究和工程應(yīng)用表明，在中高溫過渡區(qū)間中，中溫和高溫菌可實現(xiàn)共存協(xié)同，反應(yīng)效率疊加，可以顯著提升生物質(zhì)厭氧產(chǎn)沼效能和穩(wěn)定性。然而，中高溫厭氧產(chǎn)沼微生物的研究還處于空白階段，亟待建立中高溫生物質(zhì)高效厭氧產(chǎn)沼菌劑及其配套創(chuàng)新技術(shù)體系。挖掘中高溫高效厭氧纖維素降解與產(chǎn)甲烷菌種資源，組配標準化中高溫厭氧微生物功能菌劑，是助力環(huán)保、農(nóng)業(yè)等行業(yè)厭氧產(chǎn)沼領(lǐng)域突破技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在一種適用于中溫和中高溫厭氧消化提升纖維素轉(zhuǎn)化甲烷率和甲烷產(chǎn)量的厭氧菌劑及其方法，以便解決現(xiàn)有生物質(zhì)廢棄物纖維素降解難、容積產(chǎn)氣率低等問題，同時部分建立中高溫生物質(zhì)高效厭氧產(chǎn)沼菌劑及其配套創(chuàng)新技術(shù)體系。

2、本發(fā)明具體采用的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種提升中溫和中高溫纖維素厭氧產(chǎn)甲烷率的厭氧菌劑，所述中溫和中高溫的溫度區(qū)間為30~50℃，所述厭氧菌劑為由白蟻梭菌（ruminiclostridium?cellobioparum?subsp.?termitidis）菌液、乙醇嗜熱厭氧菌（thermoanaerobacter?ethanolicus）菌液、煎盤梭菌（clostridium?sartagoforme）菌液和巴氏甲烷八疊球菌（methanosarcina?barkeri）菌液配制而成的中性的復(fù)合厭氧微生物液體菌劑。

4、作為上述第一方面的優(yōu)選，所述白蟻梭菌（ruminiclostridium?cellobioparumsubsp.?termitidis）、乙醇嗜熱厭氧菌（thermoanaerobacter?ethanolicus）、煎盤梭菌（clostridium?sartagoforme）和巴氏甲烷八疊球菌（methanosarcina?barkeri）均采用購自中國厭氧微生物菌種保藏管理中心（china?collection?of?anaerobicmicroorganisms,?ccam）的商品化菌劑，保藏號分別為ccam?8945、ccam?8840、ccam?196和ccam?8220。

5、作為上述第一方面的優(yōu)選，所述厭氧菌劑中白蟻梭菌（ruminiclostridiumcellobioparum?subsp.?termitidis）、乙醇嗜熱厭氧菌（thermoanaerobacterethanolicus）、煎盤梭菌（clostridium?sartagoforme）和巴氏甲烷八疊球菌（methanosarcina?barkeri）的體積比為1：(0.5~2)：(1~3)：(1~2)，每一種菌液中厭氧菌含量均不少于2億個/毫升。

6、作為上述第一方面的優(yōu)選，所述厭氧菌劑中白蟻梭菌（ruminiclostridiumcellobioparum?subsp.?termitidis）、乙醇嗜熱厭氧菌（thermoanaerobacterethanolicus）、煎盤梭菌（clostridium?sartagoforme）和巴氏甲烷八疊球菌（methanosarcina?barkeri）的體積比為1：1：1：(1~2)，進一步優(yōu)選為1：1：1：1。

7、作為上述第一方面的優(yōu)選，所述厭氧菌劑的ph為6.8~7.2。

8、第二方面，本發(fā)明提供了一種提升中溫和中高溫纖維素厭氧產(chǎn)甲烷率的厭氧菌劑制備方法，其包括：

9、s1：分別將白蟻梭菌（ruminiclostridium?cellobioparum?subsp.?termitidis）、乙醇嗜熱厭氧菌（thermoanaerobacter?ethanolicus）、煎盤梭菌（clostridiumsartagoforme）和巴氏甲烷八疊球菌（methanosarcina?barkeri）接種至各自的液體培養(yǎng)基中，在厭氧環(huán)境中擴大培養(yǎng)至厭氧菌含量不少于2億個/毫升，得到4種菌液；

10、s2：將4種菌液在厭氧氣氛中按體積比1：(0.5~2)：(1~3)：(1~2)進行混合，并用緩沖液調(diào)節(jié)ph至6.8~7.2，得到復(fù)合厭氧微生物液體菌劑。

11、作為上述第二方面的優(yōu)選，所述緩沖液為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀緩沖液。

12、作為上述第二方面的優(yōu)選，所述擴大培養(yǎng)需在44~46?℃溫度下，于160~200?rpm振蕩下培養(yǎng)48~72?h。

13、作為上述第二方面的優(yōu)選，液體培養(yǎng)基的配方具體如下：

14、白蟻梭菌（ruminiclostridium?cellobioparum?subsp.?termitidis）的培養(yǎng)基配方如下：磷酸二氫鉀?0.20g，氯化銨?0.30?g，氯化鈉?1.00?g，氯化鎂六水合物?0.40?g，氯化鉀?0.50g，氯化鈣二水合物?0.15?g，纖維二糖?5.00?g，碳酸鈉?1.00g，酵母提取物?0.50g，九水硫化鈉?0.40?g，0.1%刃天青鈉溶液?0.50?ml，微量元素溶液?1.00?ml，無菌水?1.00l；

15、乙醇嗜熱厭氧菌（thermoanaerobacter?ethanolicus）的培養(yǎng)基配方如下：氯化銨0.90?g，氯化鈉?0.90?g，氯化鎂六水合物?0.40?g，磷酸氫二鉀?1.50?g，磷酸二氫鉀?0.75g，胰蛋白胨?2.00?g，酵母提取物?1.00?g，纖維二糖?1.00?g，l-半胱氨酸鹽酸鹽?0.75g，0.1%刃天青鈉溶液?0.50?ml，微量元素溶液?1.00?ml，氯化鐵六水合物溶液（0.1%?w/v?溶于?0.20?mol/l?鹽酸）?2.50?ml，無菌水?1.00?l；

16、煎盤梭菌（clostridium?sartagoforme）的培養(yǎng)基配方如下：牛肉膏粉?10.00?g，蛋白胨?30.00g，酵母提取物?5.00?g，葡萄糖?4.00g，纖維二糖?1.00?g，麥芽糖?1.00?g，可溶性淀粉?1.00g，磷酸二氫鉀?5.00?g，?l-半胱氨酸鹽酸鹽?0.50?g，1?mol/l?氫氧化鈉25.00?ml,0.1%刃天青鈉溶液?0.50?ml，無菌水?1.00?l；

17、巴氏甲烷八疊球菌（methanosarcina?barkeri）的培養(yǎng)基配方如下：磷酸氫二鉀0.35?g，磷酸二氫鉀?0.23?g，氯化銨?0.50?g，硫酸鎂七水合物?0.50?g，氯化鈣二水合物0.25?g，氯化鈉?2.25?g，蛋白胨?2.00g，酵母提取物?2.00?g，乙酸鈉?2.50?g，碳酸氫鈉2.00?g，l-半胱氨酸鹽酸鹽?0.50?g，九水硫化鈉?0.30?g，50%?v/v甲醇溶液?20.00?ml，0.1%刃天青鈉溶液?0.50?ml，微量元素溶液?1.00?ml，維生素溶液?1.00?ml，無菌水?1.00l；

18、上述各培養(yǎng)基配方中，所用的微量元素溶液的配方如下：硫酸亞鐵七水合物1.00g，硫酸鋅七水合物?1.00g，硼酸?6.00?mg，硫酸錳一水合物?150.00?mg，硫酸銅五水合物?3.00?mg，氯化鈷六水合物?190.00?mg，氯化鎳六水合物?24.00?mg，鉬酸鈉二水合物36.00mg，鎢酸鈉二水合物?15.00?mg，十二水合硫酸鋁鉀?10.00?mg，氮三乙酸?1.50?g，無菌水?1.00?l；

19、上述各培養(yǎng)基配方中，所用的維生素溶液的配方如下：硫辛酸?5.00?mg，煙酸5.00?mg，對氨基苯甲酸?5.00?mg，泛酸鈣?5.00?mg，鹽酸硫胺素?5.00?mg，核黃素?25.00mg，鹽酸吡哆醇?10.00?mg，生物素?2.00?mg，葉酸?2.00?mg，鈷胺酸?0.10?mg，無菌水?1.00l。

20、第三方面，本發(fā)明提供了一種提升中溫和中高溫纖維素厭氧產(chǎn)甲烷率的方法，其做法是將上述第一方面任一項所述的提升中溫和中高溫纖維素厭氧產(chǎn)甲烷率的厭氧菌劑，投加至含有產(chǎn)甲烷菌和纖維素的厭氧污泥體系中混勻，在中溫30~40℃或中高溫40~50℃的溫區(qū)范圍內(nèi)進行厭氧發(fā)酵，以提升纖維素轉(zhuǎn)化甲烷率和甲烷產(chǎn)量。

21、作為上述第三方面的優(yōu)選，所述厭氧菌劑的投加量為厭氧污泥體積的1~10%，所述厭氧發(fā)酵的溫區(qū)范圍為43~47℃。

22、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，具有以下有益效果：

23、（1）本發(fā)明挑選的菌種能夠在中溫和中高溫（30~50℃，優(yōu)選為35~47℃）環(huán)境下快速生長代謝，且單一菌群含量不低于2億個/毫升；

24、（2）本發(fā)明通過4株菌種間的協(xié)同代謝作用，可實現(xiàn)在中溫和中高溫下（35~47℃）顯著提升纖維素轉(zhuǎn)化甲烷率（大于40%）和甲烷產(chǎn)量（大于120%）；

25、（3）本發(fā)明的菌劑由4株市售協(xié)同菌復(fù)合構(gòu)建而成，菌種獲取方便，培養(yǎng)過程簡單易行，制備方便，施用方法簡單。