本發(fā)明總體上涉及與csf1r和cd3結(jié)合以例如用于活化t細(xì)胞的抗體。此外，本發(fā)明涉及編碼此類抗體的多核苷酸，以及包含此類多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生這些抗體的方法，以及涉及使用這些抗體治療疾病、特別是治療急性髓系白血病(aml)的方法。

背景技術(shù)：

1、急性髓系白血病(aml)為成人中最常見的急性白血病，并且其分子異質(zhì)性已經(jīng)使新穎治療劑的成功開發(fā)變得復(fù)雜(the?cancer?genome?atlas?research?network,n?englj?med(2013)；368:2059-2074)。盡管大多數(shù)接受聯(lián)合化學(xué)療法的患者有前期治愈意圖，但疾病復(fù)發(fā)頻繁，超過50％經(jīng)治療的患者會(huì)出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)(thol和ganser,curr?treatoptions?oncol(2020)；21(8):66。復(fù)發(fā)后，同種異體造血干細(xì)胞移植(allo-hsct)仍然是唯一的治愈方法，但即便如此，長(zhǎng)期存活概率也低于20％。因此，針對(duì)aml的創(chuàng)新治療選項(xiàng)代表高度未滿足的醫(yī)療需求。

2、患有難治性或復(fù)發(fā)性aml的患者的預(yù)后始終很差(megias-vericat等人，annhematol.(2018)；97(7):1115-115)。據(jù)推測(cè)，一個(gè)可能的原因是免疫療法缺乏相關(guān)靶特異性，并且與經(jīng)由在靶但脫aml(on-target-off-aml)檢測(cè)產(chǎn)生的毒性相關(guān)(gattinoni等人，nat?rev?immunol.(2006)；6(5):383-93)。

3、因此，有必要鑒定出更有希望的靶分子。針對(duì)aml的理想靶結(jié)構(gòu)應(yīng)盡可能廣泛且同質(zhì)地表達(dá)在aml細(xì)胞上，但不表達(dá)在健康造血細(xì)胞上(或至少僅表達(dá)在不常見的亞型上)。目前，尚未鑒定出嚴(yán)格的aml特異性或癌癥特異性表面抗原(he等人，blood.(2020)；5；135(10):713-723.)。這被認(rèn)為是因?yàn)榇祟惏薪Y(jié)構(gòu)也很可能在健康造血或相關(guān)細(xì)胞類型的細(xì)胞上表達(dá)(這也解釋了與通過目前為止所測(cè)試的各種療法來靶向此類抗原相關(guān)的大多數(shù)預(yù)期和觀察到的毒性)。與此相反，在健康細(xì)胞上不顯著表達(dá)的靶結(jié)構(gòu)具有以下缺點(diǎn)：它們通常在aml母細(xì)胞上不均勻表達(dá)，或僅在特異性aml亞型中表達(dá)，從而限制了普遍適用性。因此，靶向更受限制的標(biāo)志物的預(yù)期有益療法減少，并且阻礙了持久的治療效果。

4、t細(xì)胞已被確定為腫瘤學(xué)中的主要靶結(jié)構(gòu)和效應(yīng)子。與靶細(xì)胞上的表面抗原和活化性t細(xì)胞抗原(諸如t細(xì)胞上的cd3)結(jié)合的雙特異性抗體(在本文中也稱為t細(xì)胞雙特異性抗體或“tcb”)對(duì)于治療各種癌癥具有很好的前景。這種抗體與其兩個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)結(jié)合將迫使靶細(xì)胞和t細(xì)胞之間發(fā)生暫時(shí)的相互作用，導(dǎo)致t細(xì)胞受體交聯(lián)，并隨后活化任何細(xì)胞毒性t細(xì)胞，隨后裂解靶細(xì)胞。鑒于它們?cè)诎屑?xì)胞殺傷方面的效力，靶標(biāo)的選擇和靶向抗體的特異性對(duì)于t細(xì)胞雙特異性抗體避免中靶和脫靶毒性至關(guān)重要。

5、在治療aml方面，car?t細(xì)胞以及針對(duì)cd33的雙特異性抗體正在研究中。然而，它們已被證明會(huì)在臨床上導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用(wang等人，mol?ther.(2015)；23(1):184-91)，這可能是由于cd33作為靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的特異性不夠所致。這進(jìn)一步證明了有效的t細(xì)胞介導(dǎo)的aml治療對(duì)適當(dāng)?shù)陌薪Y(jié)構(gòu)和治療劑的高需求。

6、集落刺激因子1受體(csf1r)為i型單次穿膜蛋白，并且充當(dāng)針對(duì)細(xì)胞因子集落刺激因子1(csf1)的受體。已知csf1r在體內(nèi)表達(dá)于不同的骨髓亞群上，諸如m2巨噬細(xì)胞(ries等人(2014)cancer?cell?25(6),846-59)。在aml的上下文下，僅針對(duì)罕見亞型描述了csf1r信號(hào)傳導(dǎo)的擴(kuò)增及其抑制的治療潛力(edwards等人，blood.(2019)133(6),588-599)。然而，csf1r的廣泛表達(dá)和該信號(hào)傳導(dǎo)通路的廣泛應(yīng)用已經(jīng)被否認(rèn)(aikawa等人，naturemedicine(2010)；16(5),580-585；edwards等人，blood.(2019)133(6),588-599)。因此，由于其推定的低表達(dá)，csf1r尚未被認(rèn)為是針對(duì)aml的合適靶結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇且出乎意料地發(fā)現(xiàn)，與本領(lǐng)域的報(bào)道相反，csf1r為基于t細(xì)胞的療法提供了令人驚訝地有效的靶標(biāo)。從所附實(shí)例可以明顯看出，csf1r被顯示出在大多數(shù)aml亞型上表達(dá)，而健康細(xì)胞上的表達(dá)僅限于不同的骨髓亞群，諸如m2巨噬細(xì)胞。本文進(jìn)一步證明了csf1r作為廣泛表達(dá)的aml靶結(jié)構(gòu)，可以有效地用作抗體療法中的靶分子。

2、本發(fā)明部分基于對(duì)csf1r作為血液癌癥、特別是aml的標(biāo)志物的認(rèn)識(shí)，在正常細(xì)胞上表達(dá)有限，因此涉及csf1r靶向劑及其在治療以表達(dá)csf1r為特征的癌癥、特別是aml中的用途。

3、本發(fā)明提供與csf1r結(jié)合的抗體，具體是多特異性(例如雙特異性)抗體。特別地，本發(fā)明提供與csf1r和cd3結(jié)合的抗體，其能夠特異性結(jié)合并誘導(dǎo)t細(xì)胞介導(dǎo)的aml細(xì)胞殺傷。這些(多特異性)抗體進(jìn)一步結(jié)合了良好的功效和可生產(chǎn)性以及低毒性和有利的藥代動(dòng)力學(xué)特性。

4、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種與cd3和集落刺激因子1受體(csf1r)結(jié)合的抗體，該抗體包含：與cd3結(jié)合的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及與csf1r結(jié)合的第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選的第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)，該重鏈可變區(qū)包含seq?id?no:1的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(hcdr)1、seq?id?no:2的hcdr?2和seq?id?no:3的hcdr?3，該輕鏈可變區(qū)包含seq?id?no:4的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(lcdr)1、seq?id?no:5的lcdr?2和seq?id?no:6的lcdr?3。在一個(gè)方面，第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vh包含與seq?id?no:7的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和/或第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的vl包含與seq?id?no:8的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在特定的方面，第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和在存在時(shí)的第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含vh和vl，該vh包含seq?id?no:21的hcdr?1、seq?idno:22的hcdr?2和seq?id?no:23的hcdr?3；該vl包含seq?id?no:24的lcdr?1、seq?id?no:25的lcdr?2和seq?id?no:26的lcdr?3。在進(jìn)一步的特定方面，第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和在存在時(shí)的第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含vh和/或vl，該vh包含與seq?id?no:27的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，該vl包含與seq?id?no:28的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一方面，第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和在存在時(shí)的第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含vh和vl，該vh包含seq?id?no:9的hcdr?1、seq?id?no:10的hcdr?2和seq?id?no:11的hcdr?3，該vl包含seq?id?no:12的lcdr1、seq?id?no:13的lcdr?2和seq?id?no:14的lcdr?3。在進(jìn)一步的方面，第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和在存在時(shí)的第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含vh和/或vl，該vh包含與seq?id?no:15的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，該vl包含與seq?idno:16的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

5、在一個(gè)方面，所述第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或在存在時(shí)的第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是fab分子。

6、在一個(gè)方面，第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閒ab分子，其中fab輕鏈和fab重鏈的可變結(jié)構(gòu)域vl和vh彼此替換或恒定結(jié)構(gòu)域cl和ch1彼此替換，特別是可變結(jié)構(gòu)域vl和vh彼此替換。

7、在一個(gè)方面，第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和在存在時(shí)的第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)槌Ｒ?guī)fab分子。

8、在一個(gè)方面，第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及在存在時(shí)的第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閒ab分子，其中在恒定結(jié)構(gòu)域cl中，位置124處的氨基酸獨(dú)立地經(jīng)賴氨酸(k)、精氨酸(r)或組氨酸(h)取代(根據(jù)kabat編號(hào))，并且位置123處的氨基酸獨(dú)立地經(jīng)賴氨酸(k)、精氨酸(r)或組氨酸(h)取代(根據(jù)kabat編號(hào))；而在恒定結(jié)構(gòu)域ch1中，位置147處的氨基酸獨(dú)立地經(jīng)谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)取代(根據(jù)kabat?eu索引編號(hào))，并且位置213處的氨基酸獨(dú)立地經(jīng)谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)取代(根據(jù)kabat?eu索引編號(hào))。

9、在一個(gè)方面，第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域彼此融合，任選地經(jīng)由肽接頭融合。

10、在一個(gè)方面，第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域各自為fab分子，并且(i)第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在fab重鏈的c末端處與第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fab重鏈的n末端融合，或者(ii)第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在fab重鏈的c末端處與第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fab重鏈的n末端融合。

11、在一個(gè)方面，抗體包含fc結(jié)構(gòu)域，該fc結(jié)構(gòu)域包含第一亞基和第二亞基。

12、在一個(gè)方面，第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及在存在時(shí)的第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域各自為fab分子，并且抗體包含fc結(jié)構(gòu)域，該fc結(jié)構(gòu)域包含第一亞基和第二亞基；并且其中(i)第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在fab重鏈的c末端處與第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fab重鏈的n末端融合，并且第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在fab重鏈的c末端處與fc結(jié)構(gòu)域的第一亞基的n末端融合，或者(ii)第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在fab重鏈的c末端處與第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fab重鏈的n末端融合，并且第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在fab重鏈的c末端與fc結(jié)構(gòu)域的第一亞基的n末端融合；并且第三抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在存在時(shí)在fab重鏈的c末端處與fc結(jié)構(gòu)域的第二亞基的n末端融合。

13、在一個(gè)方面，fc結(jié)構(gòu)域是igg，特別是igg1?fc結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，fc結(jié)構(gòu)域是人fc結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，fc包含促進(jìn)fc結(jié)構(gòu)域的第一亞基和第二亞基進(jìn)行締合的修飾。在一個(gè)方面，fc結(jié)構(gòu)域包含降低與fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)功能的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。

14、根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼本發(fā)明的抗體的分離的多核苷酸和包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的宿主細(xì)胞。

15、在另一方面，提供了產(chǎn)生與cd3和csf1r結(jié)合的抗體的方法，該方法包括以下步驟：(a)在適合表達(dá)該抗體的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，以及任選地(b)回收該抗體。本發(fā)明還涵蓋通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的與cd3和csf1r結(jié)合的抗體。

16、本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的抗體和藥用載體的藥物組合物。

17、本發(fā)明還涵蓋使用本發(fā)明的抗體和藥物組合物的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用作藥物的根據(jù)本發(fā)明的抗體或藥物組合物。在一個(gè)方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的用于治療疾病的抗體或藥物組合物。還提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體或藥物組合物在制造藥物中的用途，以及根據(jù)本發(fā)明的抗體或藥物組合物在制造用于治療疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種治療個(gè)體中的疾病的方法，包括向所述個(gè)體施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體或藥物組合物。在某些方面，該疾病為癌癥。在特定的方面，疾病為以表達(dá)csf1r為特征的癌癥。在甚至更特定的方面，疾病為急性髓系白血病(aml)。